Мікробіологія - практичні роботи

1. Проводити мікроскопію препарату з використанням імерсійного об’єктиву, зробити висновок про морфологічні властивості досліджуваних мікроорганізмів.

Суть: Готуємо препарат-мазок на предметному склі із матеріалу або чистих культур мікроорганізмів і досліджуємо у мікроскопі з метою виявлення збудників захворювань чи дослідження їх морфологічних і тинкторіальних властивостей.

Для фарбування використовують анілінові барвники - це похідні аніліну, які використовують для фарбування мікроорганізмів з метою збільшення їх контрастності та подальшої мікроскопії.

При мікроскопії використовується імерсійна система, яка складається з імерсійного об'єктиву (х 90) та імерсійного масла, яке забезпечує концентрацію променів, що проходять через мікроскопічний об'єкт в об'єктив і, таким чином, забезпечує кращі умови для дослідження мікроорганізмів.

Методика виготовлення бактеріального препарату-мазку

1. Приготування суспензії бактерій (беремо бактеріологічну петлю, прокалюємо в пальнику, на предметне скло наносимо бактеріальною петлею краплинку фізрозчину, потім вносимо бактеріальною петлею культуру бактеріальних клітин з пробірки чи чашки Петрі і розтираємо по кругу)

2. Висушування суспензії бактерій (над вогнем) та одержання мазку.

3. Фіксація мазку (проводимо предметним склом через вогонь 3 рази). Мета фіксації: вбити мікроби, закріпивши їх на склі і забезпечити краще їх фарбування.

4. Фарбування мазку (фарбують бактерії різними методами, але в основному методом Грама)

5. Промивання (дистильованою водою змиваємо залишки барвника)

6. Висушування препарату-мазку (легенько промокуємо фільтрувальним папером і даємо підсохнути остаточно на повітрі).

На готовий препарат наносимо краплину імерсійного масла і ставимо на предметний столик мікроскопу, спочатку шукаємо поле зору під звичайним об'єктивом, а потім під імерсійним, що дає збільшення в 90 разів, опускаємо об'єктив до моменту, коли він доторкнеться до краплинки імерсійного масла! Регулюємо мікрогвинтом!

Висновок: якщо в полі зору круглі бактерії, то за морфологією - коки (чи кокоподібні), якщо палички – бацили (чи паличкоподібні), якщо спіралеподібні, то звивисті. Якщо забарвлення фіолетове чи синє — грампозитивиі, якщо червоне чи рожеве — грамнегативні.

2. Приготувати бактеріальний препарат, зафарбувати за методом Грама, здійснити мікроскопію з використанням імерсійного об’єктиву, зробити висновок про чистоту досліджуваної культури мікроорганізмів. Описати культуральні властивості колоній мікроорганізмів, які виросли на МПА. Обгрунтувати наступний хід досліджень.

Методика виготовлення бактеріального препарату-мазку

1.Приготування суспензії бактерій на предметному склі.

2.Висушування суспензії бактерій та одержання мазку.

3.Фіксація мазку. Мета фіксації: вбити мікроби, закріпити їх на склі і забезпечити краще їх фарбування.

4.Фарбування мазку.

5.Промивання.

6.Висушування препарату-мазку.

Методика фарбування за Грамом.

1.На фіксований жаром мазок кладуть смужку фільтруючого паперу, на який наносять розчин генціанвіолету на 1-2 хв., після чого розчин зливають, не змиваючи його водою.

2.Наносять на мазок розчин Люголя до сильного потемніння препарату на 1-2 хв.

3.Зливають розчин Люголя, не змиваючи його водою, і знебарвлюють мазок 96% спиртом протягом 15-20 (30-60) сек. (до відходження сіро-фіолетових струмочків фарби)

4.Препарат ретельно промивають водою.

5.Наносять на мазок розчин фуксину Пфейфера на 1-2 хв.

6.Мазок промивають водою, висушують фільтрувальним папірцем, наносять краплю імерсійної олії, мікроскопують з імерсійним об’єктивом.

Результати: грам позитивні мікроорганізми – темно-фіолетові, а грам негативні – рожеві.

Чиста культура - це популяція мікроорганізмів одного виду, яка вирощена на стерильному поживному середовищі. Чистоту досліджуваної культури ми визначаємо при розгляді під мікроскопом. Якщо культура чиста, то спостерігатимемо бактерії одної морфології і одного забарвлення

МПА – м'ясо-пептонний агар, одне з універсальних (простих) середовищ. Середовизще щільне, бо конц. агару 2%. На ньому ростуть тільки аеробні мікроорганізми

Культуральні властивості колоній, що виросли на МПА

1. Профіль: плоский, плоско-припіднятий, злегка опуклий, горбистий, опукло-порізаний, з вдавленим центром, з опуклим центром, куполоподібний.

2. Форма: кругла, розетко подібна, зірчаста, листковидна, тощо.

3. Контур краю: рівний, зубчастий, хвилястий, фестончатий, війчастий, бахромчастий, нитчастий, гіллястий.

4. Консистенція: суха, волога, слизиста.

5. Колір: білий, жовтий, червоний; безбарвні. Відзначають, чи виділяється пігмент у середовище.

6. Прозорість: прозорі, напівпрозорі, непрозорі.

7. Поверхня: гладка, шорстка, зморшкувата, горбиста; блискуча, матова.

8. Структура: однорідна, дрібнозерниста, грубозерниста, волокниста.

9. Розмір: великі (діаметр більш як 4-5 мм), середні (2-4 м), дрібні (1-2 мм).

Якщо діаметр становить менш 1 мм, то такі колонії називають точковими.

Після виділення чистої культури бактерій приступають до ідентифікації (визначення виду мікроорганізму). З метою ідентифікації чистої культури бактерій (визначення виду мікроорганізмів) необхідно:

1. Вивчити морфологічні і тинкторіальні властивості (фарбування за Грамом або іншим методом).

2. Визначити активну рухливість (методи «роздавленої» або «висячої» краплі).

3. Вивчити культуральні властивості (тип колоній, характер росту культури в рідких і на твердих поживних середовищах).

4. Вивчити ферментативні властивості (посів на диференціально-діагностичні середовища).

5. Визначити антигенні властивості (здійснити серологічні реакції).

6. Визначити чутливість культури до специфічного фагу.

7. Визначити патогенність (зараження лабораторних тварин).

8. Визначити інші властивості (за необхідністю).

3. Описати властивості колоній мікроорганізмів, які виросли на середовищі Ендо. Знайти колонії, які характерні для E.coli. Пояснити сутьвикористання диференціально-діагностичних середовищ з вуглеводами.

Диференціально-діагностичні середовища — це середовища, які дозволяють визначити певні біохімічні властивості мікроорганізмів і проводити їх диференціацію. Вони поділяються па середовища для визначення протеолітичних, пептолітичних, цукролітичних, гемолітичних, редукуючих властивостей бактерій.

Середовище Ендо використовується для виявлння ферментації вуглеводів.Це середовище дозволяє виявити розкладання лактози бактеріями. Воно дозволяє проводити первину диференціацію бактерій кишкового тракту, що надзвичайно важливо для швидкого виділення чистих культур з їх наступною ідентифікацією.

Склад середовища Ендо: Сухий живильний агар Субстрат — 1 % лактоза Індикатор — основний фуксин знебарвлений розчином сульфіту натрія.

Колонії, що характерні для E.coli:

-колонії забарвлюються у малиново-червоний колір з металевим блиском.,

-колонії мають дископодібну форму, злегка опуклі з рівними краями.

-Ферментують лактозу.(лактозопозитивні)

Колонії лактозо негативних мікробів сальмонели, пшгели на цьому середовищі безбарвні.

Під час доторкання до колонії петлею можна визначити її консистенцію: пастоподібна, в’язка або слизова, суха, крихка тощо.

Результат пошуку зображень за запитом "e coli на среде эндо"

Характеризувати колонії можна за різними ознаками:

-За величиною (діаметром) їх поділяють на великі (4–6 мм і більше), середні (2–4 мм), дрібні (1–2 мм), карликові або точкові (менше 1 мм).

-Форма колоній може бути найрізноманітнішою: правильно кругла, неправильна (амебоподібна), ризоїдна.

-Вони бувають прозорими, що пропускають світло, і мутними.

-За рельєфом і контуром форми у вертикальному розрізі колонії поділяють на плоскі, опуклі, куполоподібні, краплеподібні, конусоподібні, плоскоопуклі, плоскі, що стеляться по поверхні середовища, із вдавленим центром, з припіднятою у вигляді соска серединою.

-Поверхня колоній може бути матовою або блискучою, з глянцем, сухою або вологою, гладенькою або шорсткою. Гладенькі колонії позначають як S-форми (smooth – гладенький), а шорсткі – R-форми (rough – шорсткий, нерівний).

-Форма шорстких поверхонь також може бути різноманітною: зморшкуватою, бородавчастою, шагреневою, мати радіальну посмугованість тощо.

-Переважна більшість мікроорганізмів утворює безбарвні колонії або мутно-молочного кольору. Однак деякі з них формують кольорові колонії. Їх колір визначається пігментом, який синтезують бактерії: білі, кремові, жовті, золотисті, сині, червоні тощо.

-Під час доторкання до колонії петлею можна визначити її консистенцію: пастоподібна, в’язка або слизова, суха, крихка тощо.

4. Обгрунтувати суть вакцинопрофілактики. Підібрати 2-3 живі вакцини, пояснити принципи їх виготовлення і використання.

Вакцинація — введення антигенного матеріалу з метою породити імунітет до інфекційної хвороби, який запобігає зараженню або ослабляє його негативні наслідки.

Виділяють 4 покоління вакцин:

живі, але ослаблені штами мікроорганізмів або вірусів;
вакцини з антигенних компонентів мікроорганізмів;
генно-інженерні (рекомбінантні) вакцини;
синтетичні кон’юговані вакцини.

Живі вакцини належать до першого покоління і являють собою препарати, що складаються з живих вакцинних штамів мікроорганізмів, вирощених на різних поживних субстратах або чутливих біологічних моделях.

Розрізняють живі дивергентні та атенуйовані вакцини.

·Дивергентними називають вакцини, отримані в результаті добору мікроорганізмів з близькими антигенними властивостями. Прикладом таких вакцин є вакцина проти натуральної віспи Е. Дженнера.

·Атенуація – штучне зниження вірулентності. Одним із способів є культивування мікроорганізмів на нетипових для збудників поживних середовищах. Мікроорганізм може знизити вірулентність після тривалої дії на нього температурних факторів.

До переваг живих вакцин можно віднести їх природний шлях введення. Для таких вакцин характерний тривалий напружений імунітет, менша, порівняно з іншими вакцинами, кількість введень препарату та формування загального і місцевого імунітету.

Прикладом живих вакцин є вакцини проти:

·кору;

·поліомієліту;

·грипу;

·туберкульозу (БЦЖ);

·сказу;

·висипного тифу;

·сибірки;

·епідемічного паротиту.

5. Обгрунтуйте суть вакцинопрофілактики. Підібрати 2-3 убиті вакцини, пояснити принципи їх виготовлення і використання.

Вакцинація – один із методів штучної активної імунізації, що передбачає введення вакцинного антигену – ослабленого чи вбитого патогену, або штучно синтезованого білоку, який ідентичний білку патогена. Суть вакцинації полягає у індукції імунної відповіді та формуванні імунної пам‘яті, що забеспечує активну і пасивну стійкість до повторного потрапляння інфекційного збудника. Ціль – формування високоспецифічного тимчасового чи постійного імунітету.

Убиті вакцини - вакцини першого покоління, які одержали шляхом інактивації мікроорганізмів.

Одержання: проводять відбір вірулентних штамів бактерій чи вірусів,які мають повний набір необхідних антигенів та інактивують їх. Для інактивації використовують фізичні (нагрівання, висушування, ультрафіолетове випромінювання, іонізуюче випромінювання) і хімічні методи(обробка формаліном,ацетоном,спиртом).

Переваги:

1.Можливість добору високоантигенних штамів мікроорганізмів.

2.Зручне дозування, можна довгий час зберігати.

3.Відсутність впливу на генетичний апарат.

4.Неможлива реверсія вірулентності.

5.Практично відсутня можливість контамінації.

Недоліки:

1.Слабший (порівняно з живими вакцинами) імунітет.

2.Парентеральне введення.

3.Відсутність місцевого імунітету.

4.Значна кількість баластних речовин,які можуть стати причиною алергічних реакцій.

Вакцина проти гепатиту А: культивування штаму HM 175 відбувається у культурах людських фібробластів. Потім здійснюються виділення вірусу, інактивація за допомогою формальдегіду та додавання гідроксиду алюмінію як ад'юванта.

Вакцина Солка проти поліомієліну: містить вірус поліомієліту, убитий формаліном. А також антибіотики - неоміцин, стрептоиіцин та поліміцин. Проте може бути як три-, так і моновалентною. Має підвищену імуногенність для підшкірного введення.

6. Пояснити суть антитоксичного імунітету. Підібрати препарати для створення активного антитоксичного імунітету.

Імунітет антитоксичний - несприйнятливість організму до інфекційних захворювань, збудники яких продукують екзотоксини. Імунітет антитоксичний досягається активною імунізацією, введенням в організм анатоксину, що викликає синтез антитоксинів, антитоксичних сироваток чи пасивною імунізацією.

Антитоксичний імунітет направлений на нейтралізацію мікробних отрут. В найбільш чистому вигляді антитоксичний імунітет проявляється при токсичних інфекціях (дифтерія, правець, ботулізм, газова гангрена). В механізмі антитоксичного імунітету мають значення не лише наявний титр антитоксинів, але й здатність організму до їх вироблення.

Анатоксини - препарати, які отримують із бактеріальних токсинів при дії на них формаліну (0,3 - 0,5%) протягом 3-4 тижнів при температурі 39 - 40°. Після такої обробки токсин втрачає отруйні властивості, але зберігає антигенні (імуногенні - ті, що викликають утворення антитіл). При імунізації цими препаратами в організмі виникають антитіла (антитоксини), які здатні нейтралізувати дію відповідних токсинів. Промисловість випускає:

·правцевий

·дифтерійний

·адсорбований дифтерійно-правцевий

·асоційований коклюшно-дифтерійно-правцевий

·ботуліновий

·стафілококовий

·гангренозний анатоксини

7.Пояснити суть антитоксичного імунітету. Підібрати препарати для створення пасивного антитоксичного імунітету.

АНТИТОКСИНИ — специфічні антитіла, що утворюються в організмі людини і тварини під впливом токсинів (анатоксинів) мікроорганізмів, отрут рослин і тварин і мають здатність нейтралізувати їх отруйні властивості.

Антитоксини являють собою гаммаглобуліни, здатні специфічно взаємодіяти з токсинами. Кожен антитоксин знешкоджує лише той токсин, під впливом якого утворився.

В організмі у природних умовах антоксини утворюються в результаті перенесеної токсинемічної інфекції чи носійства токсигенних мікроорганізмів, виявляються в сироватці крові і можуть забезпечувати несприйнятливість до токсинемічних інфекцій.

Антитоксичний імунітет можна створити і штучно — активною імунізацією анатоксином або введенням антитоксичної сироватки (пасивний імунітет). Антитоксичні сироватки отримують у результаті імунізації коней і великої рогатої худоби анатоксинами у зростаючих дозах, а потім і відповідними токсинами. У практичній медицині антитоксини застосовують у разі профілактики і лікування дифтерії, правця, ботулізму, стафілококового сепсису, для нейтралізації отрути змій, павуків і отрути рослинного походження. Для досягнення лікувальної дії важливим є своєчасне введення антитоксину, здатного знешкоджувати токсин, що циркулює в крові.

Введення людям антитоксичних сироваток може супроводжуватися ускладненнями, що проявляються анафілактичним шоком, сироватковою хворобою.

8. Підібрати препарати, які використовують для специфічної профілактики і терапії дифтерії, пояснити аспекти їх використання

Дифтерія - гостре інфекційне захворювання, що викликається токсигенними коринебактеріями дифтерії, передається повітряно-краллиним шляхом; характеризується місцевим фібринозним запаленням переважно слизових оболонок рото- і носоглотки, а також явищами загальної інтоксикації, ураженням серцево-судинної, нервової і видільної системи.

Токсигенність пов'язана з продукцією екзотоксину. Перелік профілактичних і лікувальних засобів.

АД —м-анатоксин (анатоксин дифтерійний очищений, адсорбований зі зменшеним вмістом антигену, рідкий)

АДП-анатоксин (анатоксин дифтерійно-правцевий очищений,адсорбований рідкий)

АДП-м-анатоксин (анатоксин дифтерійно-правцевий очищений, адсорбований із

зменшеним вмістом антигенів, рідкий)

АКДП-адсорбована кашлюково-дифтерійно-правцева вакцина.

Д.Т. Кок (адсорбована вакцина для профілактики дифтерії, кашлюку та правця)

Тетракок (комбінована вакцина для профілактики дифтерії кашлюку, правця і

поліомієліту).

Сироватка протидифтерійна, коняча, очищена, концентрована, рідка.

9. Пояснити суть імуноферментного методу досліджень. Здійснити облік ІФА, поставленого з метою серологічної діагностики ВІЛ інфекції.

Імуноферментний аналіз (ІФА) або, точніше, ферментний імуносорбентний аналіз — імунологічний метод для визначення наявності певних антигенів, шляхом реакції антиген-антитіло. Широко використовується в науково-дослідній роботі та клінічній лабораторній діагностиці. (Індикація ВІЛ, чи його компонентів в матеріалі від хворих).

Якщо антиген (молекула-мішень) являє собою білок, то його очищений препарат звичайно використають для одержання антитіл, за допомогою яких потім і виявляють дану мішень.

Існує цілий ряд підходів, що дозволяють визначити, чи відбулося зв'язування антитіла з антигеном-мішенню. Один з них — це ферментний іммуносорбентний аналіз (ELISA), що часто використовується для діагностики різноманітних антигенів.

Схема проведення аналізу

1. Підготовка підкладки для фіксації досліджуваного зразка;

2. Зразок, у якому хочуть виявити специфічну молекулу або мікроорганізм, фіксують на твердій підкладці, наприклад на пластиковій мікротитрувальній плашці, що зазвичай має 96 лунок;

3. До фіксованого зразка додають антитіло, специфічне до маркерної молекули (первинне антитіло), потім промивають лунку, щоб видалити молекули первинного антитіла, які не зв'язалися;

4. Додають вторинне антитіло, що специфічно зв'язується з первинним і не взаємодіє з маркерною молекулою. До цього антитіла приєднаний фермент (наприклад, лужна фосфатаза, пероксидаза або уреаза), що може каталізувати перетворення незабарвленого субстрату в забарвлений продукт. Промивають лунку, щоб видалити молекули, які не зв'язалися;

5. Додають незабарвлений субстрат, що впізнається та утилізується ферментом;

6. Проводять якісне або кількісне визначення пофарбованого продукту, за допомогою оцінки оптичної щільності.

10. Пояснити суть серологічної ідентифікації мікроорганізмів. Підібрати препарати, які використовують з цією метою. Принципи їх одержання.

Серологічна ідентифікація - це визначення (ідентифікація) невідомого антигену за допомогою відомих антитіл з використанням серологічних реакцій

Аглютинація являє собою процес склеювання корпускулярних антигенів (бактерії, еритроцити) при дії на них специфічних антитіл у присутності електроліту з утворенням аглютинату.

Аглютинація - це спосіб виявлення та кількісного визначення Аг або Ат, заснований на їх здатності до формування видимих конгломератів

Реакція аглютинації та склі

Матеріали:

·Культура бактерій

·Адсорбована імунна діагностична сироватка для РА на склі

·0,5% розчин ИаСІ

·Предметне скло

·Бак. петля

Хід роботи

Облік результатів.

Позитивна реакція - утворення аглютинату.

Провести ідентифікацію культури грибів роду Candida, що забарвлені імунною сироваткою, міченою флуорохромом, в препараті за допомогою імунофлуоресцснтного методу (демонстраційна робота). Зробити висновок.

ПРИ постановці прямої :ІФА досліджуваний матеріал (культури грибів роду Candida) бактеріологічною петлею наносять на знежирене предметне скло, готують тонкий мазок, висушують його на повітрі, фіксують. На зафіксований препарат наносіть 1-2 крали флуоресціюючої сироватки і фарбують Його у вологій камері 20-30 хв. при температурі 25 С. Після інкубації препарат промивають 2-4 рази забуференим ізотонічним розчином, впродовж 10-15 хв. прополіскують дистильованою водою, висушують, наносять краплю нефлуоресціюючої олії і розглядають на люмінесцентному мікроскопі за допомогою імерсійного об'єктиву. При ньому гриби роду Candida дають яскраве світіння на темному фоні.

. Розгорнута реакція аглютинації, поставлена і метою серологічної ідентифікації культури бактерій

Матеріали:

·Культура бактерій (суспензія)

·Імунна діаі поетична сиронаїка а робочому ріхзаедемиі (Г50). ткгр • 1:3200

·0,5% розчин NaCI

·Пробірки, піпетки

·+-Н-+ - повна аглютинація, рідина прозора, а на дні значна кількість білого осаду;

·+++ - рідина не зовсім прозора, осад менший;

·++ - рідина непрозора, осад ще менший;

·+ - рідина мутна, дуже незначний осад;

·- - рідина рівномірно мутна, як в контролі антигену; осад відсутній. Результат в цьому випадку вважають негативним.

Реакція імунофлуоресценції (РІФ) заснована на властивості флуоресціюючих антитіл специфічно з'єднуватись з гомологічним антигеном і викликати їх світіння в фіолетовій і ультрафіолетовій частині спектру люмінесцентного мікроскопу. РІФ специфічна, високочутлива, використовується в основному для ідентифікації антигену і може бути здійснена в кількох варіантах.

1.Пряма РІФ — заснована на використанні імунофлуоресціюючих сироваток проти кожного досліджуваного антигену.

2.Непряма РІФ — заснована на використанні двох різних сироваток. Спочатку на першому етапі вживають немічені антитіла проти досліджуваного антигену, а на другому етапі реакції утворений комплекс антиген-антитіло обробляють флуоресціюючою сироваткою, що містить антитіла проти гамма-глобулінів того виду тварин, на яких була одержана специфічна немічена сироватка.

11. Суть серологічної діагностики інфекційних захворювань. Підібрати препарати, які використовуються з цією метою, їх одержання.

Серологічні реакції - це реакції між антигенами та антитілами in vitro.

Серологічна діагностика - визначення невідомих антитіл в крові людини за допомогою відомих стандартних антигенів, що називаються діагностикумами

Всі серологічні реакції використовуються з двоякою метою:

1) для виявлення антитіл у сироватці хворого з допомогою стандартних антигенів-діагностикумів - для серологічної діагностики інфекційної хвороби;

2) для визначення невідомих антигенів (бактерій і грибів, вірусів) за відомими стандартними сироватками-антитілами - для серологічної ідентифікації збудників. При цьому невідомий компонент визначають за відомим.

Для серологічної діагностики беруть стандартні антигени - діагностикуми: суспензії інактивованих, рідше живих, бактерій, вірусів або їх антигенів у ізотонічному розчині. Для серологічної ідентифікації застосовують стандартні імунні сироватки. Їх одержують шляхом гіперімунізації тварин відповідними бактерійними чи вірусними антигенами, в результаті якої в крові проти них з'являється значна кількість антитіл. Одержавши сироватку крові імунізованої тварини і очистивши від баластних речовин, її використовують як імунну сироватку. При одержанні такої сироватки визначають її титр - найбільше розведення, в якому ще проявляється реакція з відповідним антигеном. Набори із різноманітних діагностикумів та імунних діагностичних сироваток є в кожній бактеріологічній лабораторії.

12. Пояснити суть вірусологічної діагностики грипу. Здійснити облік реакції гемаглютинації (РГА), поставленої з метою виявлення вірусу. Зробити висновок про наявність і титр вірусу.

Biрусологічний метод діагностики.

Матерiалом для дослідження є змиви з носоглотки, виділення з носа, які беруть сухими або вологими стерильними ватними тампонами в перші дні захворювання, харкотиння. Віруси можна також знайти в крові, спинномозковій рідині. Носоглоткові змиви беруть натщесерце. Хворий повинен тричі прополоскати горло стерильним ізотонічним розчином хлориду натрію (10-15 мл), який збирають у стерильну банку з широким горлом.

Після цього шматочком стерильної вати або ватним тампоном протирають задню стінку глотки, носові ходи, потім вату занурюють у банку із змивом. Після забору тампоном його занурюють у пробірку з ізотонічним розчином, до якого добавлено 5 % інактивованої сироватки тварин. У лабораторії тампони полощуть у рідині, віджимають біля стінки пробірки і видаляють. Змив витримують у холодильнику для відстоювання, потім відбирають середню частину рідини в стерильні пробірки.

До матеріалу додають антибіотики пеніцилін (200-1000 ОД/мл), стрептоміцин (200- 500 мкг/мл), ністатин (100-1000 ОД/мл) для знищення супутньої мікрофлори, витримують 30 хв при кімнатній температурі і використовують для виділення вірусів, попередньо перевіривши його на стерильність.

Найчутливішим методом виділення вірусів є зараження 10-11-денних курячих ембріонів. Матеріал в об'ємі 0,1-0,2мл вводять в амніотичну або алантоїсну порожнини. Заражають, як правило, 3-5 ембріонів. Ембріони інкубують при оптимальній температурі 33-34 °С протягом 72 год. 3 метою збільшення кількості віріонів у досліджуваному матеріалі його попередньо концентрують. Для цього використовують методи адсорбції вірусів на курячих еритроцитах, обробку 0,2% розчином трипсину з метою підсилення інфекційних властивостей вірусів або осаджують їх за спеціальними методиками.

Після інкубації курячі ембріони охолоджують при температурі 4 °С протягом 2-4 год, потім відсмоктують стерильними піпетками або шприцем алантоїсну чи амніотичну рідину.

У ній за допомогою РГА визначають наявність інфекційного вірусу.

Для цього змішують рівні об'єми (0,2 мл) вірусмісткого матеріалу і 1 % зависі еритроцитів курей.

Про позитивну реакцію (наявність вірусу в матеріалі) свідчить осідання еритроцитів у вигляді парасольки.

За умови наявності в матеріалі вірусу, який має гемаглютинуючі властивості, його титрують за допомогою розгорнутої РГА, визначаючи титр гемаглютинуючої активності (див табл. нижче). За допомогою цієї реакції визначають титр гемаглютинуючого вірусу - найбільше розведення матеріалу, яке ще дає реакцію гемаглютинації. Цю кількість вірусу приймають за одну гемаглютинуючу одиницю (ГАО).

Також для виділення вірусу можна використовувати культури клітин – ембріону людини, нирок мавп, MDCK - перещеплювані лінії клітин нирок собак. У них проявляється ЦПД – цитопатична дія вірусів, яка завершується дегенерацією клітин.

13. Пояснити суть вірусологічної діагностики грипу. Здійснити облік реакції гальмування гемаглютинації (РГГА), поставленої з метою серологічної ідентифікації виділеного вірусу. Зробити висновок про тип вірусу.

Безымянный

Схема постановки реакції гальмування гемаглютинації (РГГА) з метою серологічної ідентифікації вірусів грипу

Суть полягає в тому що антитіла блокують активні центри вірусу грипу і таким чином перешкоджають гемаглютинації. Реакція вважається позитивною при відсутності аглютинації еритроцитів. В нашому випадку ідентифіковано вірус грипу типу А, оскільки реакція позитивна з сироваткою грипозною А.

14. Здійснити серологічну діагностику грипу. Провести облік реакції гальмування гемаглютинації (РГГА), поставленої з парними сироватками хворого. Зробити обґрунтований висновок.

РГГА є трикомпонентною реакцією. Базується на феномені гемаглютинації за допомогою вірусів, що мають на поверхні білок гемаглютинін. Віруси адсорбуються на поверхні еритроцитів і з’єднують сусідні клітини. Такі еритроцити осідають на дно пробірки у вигляді перевернутої парасольки. Для ідентифікації застосовують РГГА, механізм полягає в дії противірусних антитіл – антигемаглютинінів, що блокують активні центри вірусних гемаглютинінів і перешкоджають склеюванню еритроцитів.

Парні сироватки:

1.Антитіла виявляють у парних сироватках, першу беруть на початку хвороби, другу - через 2 тижні.

2.Сироватки позбавляють вірусних інгібіторів.

3.Реакція вважається позитивною, якщо титр антитіл у 2 сироватці збільшився в 4 і більше рази.

Проводимо облік РГГА, що поставлена з метою серологічної діагностики грипу.

Необхідні складові:

1.Сироватка хворого на початку хвороби

2.Сироватка хворого через 2 тижні

3.Контролі:

·1 сироватка – осаджені еритроцити

·2- сироватка – осаджені еритроцити

·Контроль вірусу (парасолька)

·Еритроцити (осаджені)

Компоненти:

1.Еритроцити барана;

2.Відомий антиген;

3.Невідомі антитіла в сироватці хворого.

Розводимо 1 сироватку в титрі від 1/10 до 1/160. Позитивна РГГА реєструється в титрі,наприклад, 1/10 (осаджені неаглютиновані еритроцити, тому що шукаємо АТ, парасолька там, де не вистачає АТ і вірус аглютинує еритроцити); через 2 тижні розводимо 2 сироватку; позитивна реакція реєструється в титрі (1/80 – осаджені неаглютиновані еритроцити). Відмічається зростання титру антитіл (в 8 разів (80:10) (мінімум в 4 рази повинно бути). Пацієнт хворів на вірус грипу типу…

15. Пояснити суть вірусологічної діагностики поліомієліту. Встановити наявність вірусу у клітинних культурах, інфікованих матеріалом від хворого, за цитопатичною дією (ЦПД) і феномен бляшкоутворення. Зробити висновок.

Суть:

ЦПД – видимі під мікроскопом морфологічні зміни моношару клітин, що виникають в результаті внутрішньоклітинної репродукції вірусів.

·Ступінь вираження визначається видом вірусів, їх інфікуючою дозою, фізіологічними особливостями клітин тощо. Для зараження найчастіше використовують дози вірусів, які дорівнюють 1000 – 10000 ( – така цитопатична доза вірусів, яка викликає дегенеративні зміни в 50 % пробірок, що містять заражені культури клітиин)

Бляшки – обмежені ділянки зруйнованого вірусами моношару клітин під агаровим чи бентонітовим покриттям. Один віріон утворює потомство у вигляді однієї бляшки.

·Адсорбуючись на поверхні клітин. Бентоніт надає моношару клітин молочного кольору. внаслідок такого покриття репродукція вірусів обмежується тільки первинно інфікованими клітинами, а ЦПД проявляється формуванням вогнищ клітинної дегенерації у вигляді бляшок.

Особливості прояву цитопатичної дії – діагностика захворювання:

·Вірусам поліомієліту притаманна повна дегенерація клітинного моношару

·При повній дегенерацій клітинного моношару спостерігаються зміни в переважній більшості клітин. Вони гинуть відокремлюючись від скла. Окремі клітини, що залишаються живими, змінюють свою морфологію, в них помітний пікноз ядра і цитоплазми.

16. Пояснити суть вірусологічної діагностики поліомієліту. Здійснити облік реакції вірус нейтралізації (РН), поставленої з метою серологічної ідентифікації вірусу, виділеного від хворого. Зробити висновок про вид вірусу.

Кольорову реакцію раніше часто ставили при серологічній діагностиці поліомієліту.

ПРИНЦИП: Базується на здатності вірусу пригнічувати обмінні процеси в інфікованих культурах клітин в результаті чого зберігається вихідний колір середовища (малиновий). При постановці реакції нейтралізації антитіла сироватки крові хворих нейтралізують вірус і метаболізм клітин продовжується. Це призводить до нагромадження кислих продуктів у системі, які змінюють РН середовища і воно набуває жовтого кольору.

РЕЗУЛЬТАТИ: Результати реакції враховують візуально на 5-7 добу шляхом порівняння кольору середовища в дослідних і контрольних пробірках. Титром сироватки вважають її найбільше розведення, при якому відбулась нейтралізація вірусу (остання пробірка з культурою клітин, де середовище жовтого кольору).

Діагностичне значення має наростання титру антитіл у другій сироватці не менше, ніж у 4 рази в порівнянні з першою сироваткою.

17. Пояснити суть вірусоскопічної діагностики вірусних захворювань. Здійснити мікроскопію препарату, виготовленого з мозкової тканини, для виявлення тілець Бабеша-Негрі.

Досить часто як прояв цитопатичної дії віруси утворюють внутрішньоклітинні включення. Вони можуть локалізуватись як внутрішньоядерно, так і в цитоплазмі клітин. Їх утворення, форма, величина, наявність у них вірусних нуклеїнових кислот є важливим моментом при проведенні діагностики захворювань.

Такі включення утворюють віруси сказу (тільця Бабеша-Негрі), натуральної віспи (тільця Гварнієрі), простого герпесу (тільця Ліпшютца), аденовіруси, віруси грипу та інші.

Включення виявляють при світловій мікроскопії, фарбуючи препарати за допомогою методу Романовського-Гімзи.

З цією метою культури клітин спочатку вирощують на спеціальних скляних пластинках або пластинках із прозорої слюди. Пізніше, після одержання моношару клітин, їх заражують досліджуваним матеріалом, що містить віруси, і через деякий час забарвлюють отримані культури.

Часто для виявлення включень використовують метод імунофлуоресценції .При цьому препарати обробляють специфічними противірусними сироватками, кон’югованими з флуорохромами.

В ультрафіолетових променях люмінесцентного мікроскопа включення світяться характерним кольором. Можна довести наявність включень у матеріалі (біоптати) за допомогою електронної мікроскопії, яка дозволяє дослідити тонку структуру цих утворень, виявити окремі віріони.

Виявлення тілець Бабеша-Негрі є швидким методом діагностики сказу.

З мозку загиблої людини чи тварини стерильними ножицями нарізають у поперечному напрямку шматочки товщиною 3-4 мм з довгастого мозку, амонового рогу і мозочка. Предметне скло притискають до поверхні зрізу щоб отримати відбиток тканини.

В препаратах, забарвлених за Муромцевим або Селлером, тільця мають різну величину (4-10 мм) округлої або овальної форми пурпурно-червоні, а цитоплазма і ядра нервових клітин мають синій колір.

Гістологічні зрізи забарвлюють за Романовським-Гімзою, Манном або Туревичем. В одній клітині може бути одне або декілька тілець. Вони оточені чітко окресленою оболонкою і мають внутрішню структуру у вигляді базофільної зернистості, частіше розташовуються біля ядра.

Метод виявлення включень Бабеша-Негрі є досить специфічним для сказу, хоч він і менш чутливий, ніж метод флуоресцуючих антитіл. У тканині мозку собак тільця знаходять у 90-95 % випадків, а в людей, померлих від сказу – в 70 %.

18. Здійснити мікробіологічну діагностику гнійного процесу бактеріоскопічним методом. Здійснити мікроскопію пофарбованого препарату від хворого і зробити висновок.

Невелику кількість матеріалу стерильною бактеріологічною петлею або пастерівською піпеткою наносять на середину знежиреного предметного скла і покривають його другим склом так, щоб 1/3 верхнього і нижнього скла залиша- лась вільною. Обидва скла сильно затискають між пальцями, роздавлюють досліджуваний матеріал і за вільні кінці розводять їх у сторони. Таким способом одержують два однакових мазки Виготовлені мазки висушують при кімнатній температурі або в термостаті.

Висушені препарати необхідно фіксувати до поверхні скла. У лабораторній практиці найпоширенішим методом фіксування мазків є фламбування – тобто фіксація в полум’ї газового пальника або спиртівки. Далі препарат забарвлюють. Найчастіше використовують основний розведений фуксин Пфейфера і лужну метиленову синьку Леффлера.На зафіксований препарат наносять піпеткою таку кількість барвника, щоб він покривав увесь мазок. Після фарбування препарат промивають водопровід- ною водою і висушують на повітрі, або притискають фільтрувальним папером, потім проводять над полум’ям, щоб випарувались залишки води

Основні форми бактерій: 1-6 – сферичної форми: 1 – стафілококи; 2-3 – диплококи; 4 – стрептококи; 5 – тетра- коки; 6 – сарцини; 7-9 – паличкоподібні; 10-12 – спіралеподібні форми; 10 – вібріони; 11 – спірили; 12 – спірохети.

Виготовлення мазки з гнійних виділень з уретри або ліквору хворого на гостру гонорею, фарбують їх метиленовою синькою, за Романовським-Гімзою та Грамом.

Висновок: бактерії в мазках виглядають як грамнегативні диплококи, що мають вигляд кавових зерен, які розташовуються парами, тетрадами, або хаотично, часто всередині лейкоцитів (незавершений фагоцитоз). У такому разі, при типовій клінічній картині, первинна мікроскопія ліквору дає можливість встановити менінгококову етіологію захворювання.

19. Здійснити мікробіологічну діагностику гострої гонореї бактеріоскопічним методом. Здійснити мікроскопію пофарбованого матеріалу від хворого і зробити висновок

Збудник гонореї Nеisseria gonorrhoeae належить до родини Neisseriaceae, роду Neisseria.

Бактеріоскопічне дослідження є найпоширенішим, хоч і менш чутливим методом лабораторної діагностики гонореї в порівнянні з виділенням чистих культур.

Матеріал дослідження:

·У чоловіків досліджують виділення сечовипускного каналу, парауретральних ходів, прямої кишки

·У жінок матеріал беруть із уретри, парауретральних ходів, шийки матки, прямої кишки, а за показаннями

Із досліджуваного матеріалу виготовляють два тонкі рівномірні препарати-мазки. Один забарвлюють метиленовою синькою, другий – за методом Грама.

Висновок про наявність гонококів роблять, базуючись на таких їх

властивостях:

·грамнегативне забарвлення,

·диплококова структура,

·форма кавових зерен,

·розташування всередині лейкоцитів

Висновок мікроскопічне дослідження матеріалу хворого вказує на наявність гострої гонореї

20. Здійснити мікробіологічну діагностику гонореї бактеріоскопічним методом. Здійснити мікроскопію пофарбованого матеріалу від хворого і зробити висновок

Бактеріоскопічне дослідження

Готують два мазки, один - фарбують за Грамом, а другий – метиленовим синім, і мікроскопують.Забарвлення за граммом дозволяє диференціювати гонококи і грам позитивні бактерії

·При фарбуванні метиленовим синім інтенсивно пофарбовані гонококи особливо добре видно на фоні лейкоцитів і епітеліальних клітин, цитоплазма -блідо-блакитного кольору, ядро — синього (орієнтоване значення при мікроскопічній діагностиці гонореї, адже всі коки фарбуються в синій колір).

·Фарбування по Граму, засноване на властивості клітинної оболонки гонокока знебарвлюватися спиртом. Коки, що не відносяться до роду нейсерій, залишаються пофарбованими. Гонококи в мазку, пофарбованому по Граму, здобувають яскраво-рожевий колір і виділяються на блідо-рожевому фоні цитоплазми лейкоцитів. При внутрішньоклітинній локалізації їх спостерігають у нейтрофільних гранулоцитах. В інших клітинних формах гонококів не знаходять.

Метод фарбування за Грамом

1. На фіксований мазок наносять розчин генціанвіолету на 1-2 хв., після чого розчин зливають, не змиваючи його водою.

2.Протягом 1 хвилини обробляють мазок розчином Люголя.

3.Знебарвлюють спиртом 10-20 сек.

4.Промивають водою.

5. Дофарбовують мазок водним розчином фуксину 1-2 хвилини

Промивають водою, висушують фільтрувальним папірцем.

21. Здійснити серологічну діагностику черевного тифу і паратифів. Врахувати результати непрямої гемаглютинації (РНГА) і робити висновки.

При серологічній діагностиці використовують РНГА для виявлення Vi-антитіл у осіб підозрілих на бактеріоносійство.

Реакція ставиться:

1.З комплексним еритроцитарним діагностикумом АВСDE

2. З черевотифозним еритроцитарним діагностикумом

3.З Vi-еритроцитарним діагностикумом.

Реакцію ставлять у пластмасових планшетках з лунками.

1.У хворого беруть 2-3 мл крові, ставлять її у термостат на 30хв. для згортання.

2. Утворений згусток відділяють від стінок пробірки, вміщують на 30-40хв. у холодильник, відсмоктують сироватку.

3. Розводять сироватку у лунках від 1:10 до 1:160 в об’ємі 0,5мл.

4. У кожну лунку вносять по 0,25мл еритроцитарного діагностикуму.

5. Планшетки у термостат на 2год, потім при кімнатній температурі на 18-20год.

6. Результати враховують за 4-плюсовою системою:

·(++++) еритроцити повністю аглютинуються, на дні лунки пухкий осад у вигляді парасольки.

·(+++-) не всі еритроцити аглютинувались, парасолька менша.

·(++) аглютинат маленький, є осад неглютинованих еритроцитів.

·(-) негативна реакція, на дні лунки осад еритроцитів у вигляді монетного стовпчика.

Діагностичне значення має реакція в титрі 1:40 і вище.

Для постановки остаточного діагнозу бактеріоносійство слід виділити чисту культуру.

22. Здійснити серологічну діагностику черевного тифу і паратифів. Врахувати результати реакції Відаля, зробити висновок.

З 2-го тижня захворювання проводять серологічне дослідження з метою визначення наявності і типу антитіл такими методами:

-Реакція непрямої гемаглютинації(РНГА), яку ставлять з з О-, Н-, Vi-еритроцитарними діагностикумами. Позитивним є діагностичний титр не менше 1:200.

-Розгорнута об’ємна реакція Відаля

-Імуноферментний аналіз (ІФА)

Реакція Відаля.

Для постановки реакції аглютинації Відаля необхідно три компоненти:

1) антитіла (сироватка хворого);

2) антиген (бактерійний або еритроцитарний діагностикум);

3) 0,85 % розчин хлориду натрію (електроліт).

1. Беруть кров у хворого з вени, пальця або мочки вуха в стерильну пробірку 2-3 мл, ставлять її в термостат на 30 хв для згортання.

2. Утворений згусток обводять пастерівською піпеткою, відділяючи його від стінок пробірки, вміщують на 30-40 хв у холодильник, відсмоктують сироватку і роблять її робоче розведення 1:50.

3. Потім у шести паралельних рядах аглютинаційних пробірок роблять наступні розведення сироватки від 1:100 до 1:1600 за стандартною схемою.

Діагностикуми	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600	КД(1:100)	КС
Черевного тифа	+	+	+	+	─	─	─
Паратифу А	─	─	─	─	─	─
Паратифу В	─	─	─	─	─	─
Діагностикум, краплі	2	2	2	2	2	-	2
Інкубація в термостаті
Облік реакції

Антигени: О-, Н-, Vi-черевнотифозні діагностикуми, паратифозні Н- та О-діагностикуми.

4. В кожну пробірку ряду, окрім шостої, (контроль сироватки – КС) добавляють по 2 краплі діагностикуму. Сьома пробірка є контролем діагностикуму (КД). Штативи з пробірками енергійно струшують і ставлять на 2 год у термостат, після чого роблять попередній облік результатів реакції.

5. Остаточний облік проводять через 18-20 год знаходження пробірок при кімнатній температурі.

ü При позитивній реакції аглютинації утворюється білуватий осад на дні пробірки із більш-менш прозорою рідиною над ним.

-При негативній реакції рідина залишається каламутною, осад на дні пробірки відсутній.

23. Пояснити суть бактеріологічної діагностики черевного тифу і паратифів.

*Збудником є Salmonella typhi; Salmonella paratyphi

1. Для встановлення діагнозу в перший тиждень сіють кров (метод виділення гемокультури) у середовища накопичення: жовчний або селенітовий бульйон.

2. З подальшим пересіванням на диференціально-елективні середовища (Ендо, Плоскірєва, вісмут-сульфітний-агар).

3. Для ідентифікації виділеної культури використовують біохімічні тести і серологічні методи.

4. Починаючи з 2-го тижня захворювання проводять серологічне дослідження з метою визначення наявності і типу антитіл. Дослідження проводиться постановкою РНГА, яку ставлять з О-, Н-, і Vі- діагностикумами. Позитивним є діагностичний титр не менше 1:200. Раніше для серологічної діагностики застосовували розгорнену реакцію Відаля. У даний час використовують реакцію ІФА.

Виділення копро-, урино-, і білі культур проводять з кінця 2-го тижня захворювання. Матеріалом для дослідження є сеча, кал, жовч. Позитивні посіви крові виявляються на 3-й тиждень захворювання у 30-40% хворих.

24. Пояснити як визначається мікробне число повітря. Врахувати результати і зробити висновок. Врахувати результати біохімічної і провести серологічну ідентифікацію гемокультури, виділеної від хворого. Зробити висновок.
Для визначення мікробного числа повітря використовуємо формулу Омелянського:
Х=
Х – кількість мікроорганізмів в 1м3
а – кількість колоній, що виросли на чашці Петрі
b – час експозиції
t – площа чашки
5 – час за розрахунком Омелянського
10 – об’єм повітря в л, з якого відбувалося осадження мікроорганізмів за 5 хвилин
- площа на яку відбулося осадження
– об’єм повітря в л
Висновки робимо за таблицею наведеною нижче

Реакція аглютинації на склі з метою серологічної ідентифікації
На предметне скло наносять роздільно 2 краплі специфічної сироватки і краплю ізотонічного розчину хлориду натрію. В краплю ізотонічного розчину й одну з крапель сироватки бактеріологічною петлею вносять досліджувану культуру й ретельно її емульгують. Після внесення культури в одну із крапель необхідно простерилізувати петлю, знову набрати культуру і внести її у другу краплю. Крапля сироватки, куди не вносили культури, є контролем сироватки.
Реакція проходить досить швидко при кімнатній температурі. Якщо контрольна крапля сироватки залишається прозорою, в краплі ізотонічного розчину – рівномірне помутніння, а в краплі, де культура змішана з сироваткою, з’являються зернистість або пластівці, реакція вважається позитивною.

25. Пояснити суть бактеріологічної діагностики дизентерії. Врахувати результати біохімічної і провести серологічну ідентифікацію копрокульури, виділеної від хворого. Зробити висновок.

Бактеріологічне дослідження. Посіви випорожнень проводять паралельно на селективне середовище Плоскирєва для отримання ізольованих колоній і в селенітовий бульйон з метою накопичення шигел.

Бактеріологічною петлею вибирають слизово-гнійні шматочки, ретельно прополіскують їх у 2-3-х пробірках Nacl, наносять на середовище Плоскирєва і скляним шпателем втирають в агар на невеликій ділянці. Потім відривають шпатель від середовища і втирають ним залишковий матеріал досуха в решту незасіяної поверхні. При посіві в 2-3 чашки на кожну з них наносять нову порцію посівного матеріалу.

При відсутності слизово-гнійних шматочків фекалії емульгують у 5-10 мл 0,85 % розчину хлориду натрію і 1-2 краплі надосаду засівають на середовище Плоскирєва. У селенітовий бульйон сіють неемульговані випорожнення у співвідношенні 1:5. При посіві блювотних мас і промивних вод використовують селенітовий бульйон подвійної концентрації і забезпечують співвідношення по- сівного матеріалу до середовища 1:1. Засіяні біля ліжка хворого живильні середо- вища безпосередньо вміщують у термостат. Всі посіви вирощують при 37 °С про- тягом 18-20 год.

На другий день неозброєним оком або за допомогою лупи 5×-10× досліджу- ють характер росту на середовищі Плоскирєва, де шигели утворюють дрібні, про- зорі, безбарвні колонії.

На третій день враховують характер росту на середовищі Олькеницького. Шигели викликають характерні зміни трицукрового агару (жовтіє стовпчик, колір скошеної частинки не змінюється, почорніння відсутнє).

Підозрілу культуру сіють в середовища Гісса для визначення біохімічних властивостей, або використовують ентеротести.

Серологічна ідентифікація виділених культур проводиться за допомогою реакції аглютинації на склі спочатку з сумішшю сироваток проти видів Флекснера і Зонне, які найчастіше зустрічаються, а потім із моновидовими та монорецепторними сироватками.

Для визначення виду шигел використовують також реакцію коаглютинації. Вид збудника встановлюють за допомогою позитивної реакції з білком А золотистого стафілокока, на якому адсорбовані специфічні антитіла проти шигел. На типову колонію наносять краплю сенсибілізованого антитілами протеїну А, похитують чашку й через 15 хв під мікроскопом спостерігають появу аглютинату. Реакцію коаглютинації можна ставити вже на другий день дослідження, якщо на середовищі є достатня кількість лактозонегативних колоній.

Висновок. Бактеріологічний метод діагностики дизентерії є найдостовірнішим, але в різних лабораторіях (залежно від кваліфікації бактеріологів і лаборантів) він дає лише 50-70 % позитивних результатів. З метою встановлення джерел інфекції визначають серовари шигел.

Серологічну діагностику дизентерії проводять рідко. Інфекційний процес не супроводжується значним антигенним подразненням, тому титри антитіл у сроватці хворих і реконвалесцентів невисокі. При реакції аглютинації з мікробними діагностикумами, діагностичним титром антитіл до S.flexneri у дорослих хворих вважають 1:200, до S.dysenteriaе і S.sonnei – 1:100 (у дітей відповідно – 1:100 і 1:50).

Більш достовірні результати отримують при постановці РНГА особливо при використанні методу парних сироваток. Діагностичне значення має збільшення титру в 4 і більше разів. Еритроцитарні діагностикуми виготовляють, в основному, з антигенів S.flexneri та S.sonnei.

26. Здійснити реакцію аглютинації на склі з адсорбованим діагностичними холерними сироватками з метою серологічної ідентифікації копрокультури. Зробити висновок.

При відборі колоній використовують пробу на оксидазу або індикаторні папірці (СІП-1 – набір для ідентифікації вібріонів). Оксидазопозитивні колонії перевіряють у РА на склі( «слайд-аглютинація») з холерною сироваткою О1, у розведенні 1:100. При позитивній реакції ставлять слайд-аглютинацію з сироватками Гікошіма, Інаба й Огава(1:50), готують мазки для забарвлення за Грамом і обробляння люмінесцентними сироватками. Позитивна РА з холерною О1 або Гікошіма, Інаба й Огава-сироватками або позитивна реакція з люмінесцентними антитілами у поєднанні з морфологічними й культуральними ознаками та специфічною іммобілізацією антитілами дозволяють видати попередню відповідь про виявлення холерних вібріонів О1 серогрупи. Підозрілі колонії, що аглютинуються і не аглютинуються холерними О1-сироватками, відсівають на середовище Ресселя або лужний агар для виділення чистої культури та її ідентифікації. Далі відбирають культури із середовища Ресселя й перевіряють їх у слайд-аглютинації з холерними сироватками О1, Гікошіма, Інаба й Огава. При негативних результатах із цими сироватками ставлять слайд-аглютинацію з холерною сироваткою О139. На основі позитивної РА видають попередню або остаточну відповідь про виділення холерного вібріона О1 серогрупи відповідного сировару. Якщо виділена культура реагує з холерною сироваткою О139 при негативних результатах з О1-сироваткою, видають відповідь про виділення холерного вібріону О139 серогрупи. При виділенні від хворого або вібріононосія культури, яка не аглютинується сироватками, видають відповідь про виділення холерних вібріонів не О1 серогрупи(НАГ-вібріонів).

27. Здійснити мікробіологічну діагностику туберкульозу бактеріоскопічним методом. Провести мікроскопію пофарбованого спеціальним методом препарату із матеріалу від хворого. Зробити висновок.

Методика забарвлення мазка за Цілем-Нільсеном грунтується на кислото-, луго-, спиртостійкості збудника - здатності МБТ (мікобактерії туберкульозу) після забарвлення фуксином утримувати барвник навіть після тривалого знебарвлення кислотою або спиртом, на відміну від іншої мікробної флори.
Методика:

· на предметному склі роблять тонкий мазок із харкотиння і висушують над полум'ям пальника;

· на фіксований препарат накладають смужку фільтрувального паперу, зверху наливають розчин карболового фуксину й нагрівають над полум'ям пальника до появи парів;

· змивають залишки фарби водою;

· знебарвлюють мазок у 20%-му розчині сірчаної кислоти або в 3%-му солянокислому спирті до рожево-сіруватого кольору, промивають водою;

· дофарбовують 30 секунд 0,025%-м розчином метиленового синього.
На висушений мазок наносять краплю оливкової або рицинової олії й оглядають через імерсійну систему мікроскопа. Під мікроскопом МБТ мають вигляд паличок червоного кольору на синьому фоні препарату. Для підвищення імовірності знаходження МБТ дослідження харкотиння проводять не менше 3-х разів.

28. Здійснити мікробіологічну діагностику дифтерії бактеріоскопічним методом. Провести мікроскопію пофарбованого спеціальним методом препарату із матеріалу від хворого. Зробити висновок.

Бактеріоскопічне дослідження. Для проведення його беруть тампоном матеріал по периферії ураженої ділянки. Тонкий мазок фарбують за Грамом і за Нейссером. Вже через 1-2 години можна отримати попередню відповідь.

Методика забарвлення за Грамом полягає в тому, що на фіксований препарат накладають клаптик фільтрувального паперу, на який наливають карболовий розчин генціанвіолету на 1-2 хв. Барвник зливають і, не промиваючи препарат водою, наливають розчин Люголя на 1 хв. Зливають розчин Люголя і знебарвлюють препарат спиртом до зникнення фіолетових струмочків барвника. Промивають його водою і додатково забарвлюють протягом 1-2 хв водним розчином фуксину Пфейффера. Барвник зливають, препарат промивають водою, висушують та мікроскопують.

Методика фарбування включень у бактерій. За методом Нейссера для виявлення волютинових зерен у дифтерійних паличок на фіксований препарат на 1-2 хв наносять краплю оцетовокислого метиленового синього (барвник Нейссера), а потім рознин Люголя на 10-30 с. Промивають препарат водою та забарвлюють водним розчином везувіну або хризоїдину протягом 1 хв і знову промивають водою та висушують.

Результат: при мікроскопії видно прямі або злегка зігнуті нерухомі грампозитивні палички. Спор і капсул не утворюють. Палички потовщені на кінцях і нагадують булаву. В мазках бактерії розташовуються під кутом один до одного, у вигляді букв V, Y, L. При фарбуванні за методом Нейссера тіла бактеріальних клітин фарбуються в ніжно-жовтий колір, зерна волютину - в темно-синій.

Висновок: цей метод є орієнтовним, оскільки не дозволяє відрізнити C. diphtheriae від інших коринебактерій. Позитивний результат мікроскопічного дослідження мазків недостатній для того, щоб бути альтернативою бактеріологічному дослідженню. Негативний результат разом з тим ще не є підставою для зняття діагнозу.

29. Врахувати результати мікробіологічної діагностики гострої анаеробної інфекції прискореним методом. Зробити висновок.

До числа експрес-методів належать серологічні методи: реакція імунофлюоресценції (РІФ),

імуноферментний аналіз (ІФА),

реакція непрямої (пасивної) гемаглютинації (РНГА);

молекулярно-генетичні методи (електрофорез, метод риботипування, полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР),

метод газо-рідинної хромато- графії (ГРХ)

ГРХ базується на хроматографічному визначенні у досліджуваному матеріалі специфічних продуктів метаболізму анаеробів — летких жирних кислот (ізо- масляна і масляна, ізовалеріанова і валеріанова, ізокапронова і капронова, гексанова і каприлова кислоти), які служать молекулярними маркерами наявності анаеробів.

Виявлення у досліджуваному матеріалі наявності жирних кислот за допомогою ГРХ є переконливим доказом анаеробної етіології запального процесу.

30. Здійснити серологічну діагностику сифілісу. Врахувати результати реакції Вессермана (РВ), зробити висновок.

Реакція Вассермана - реакція зв’язування комплементу.

Для її постановки використовують сироватку крові хворого на сифіліс і спиномозкову рідину при ураженні нервової системи.

Для виконання реакції отримують сироватку крові, інактивують на водяному нагрівачі при 56⁰С 30 хв і розливають у 4 пробірки.

Використовується в реакції Васермана:

1) специфічний антиген, який містить антигени збудника – зруйновані ультразвуком трепонеми;

2) неспецифічний антиген – ліпоїдний екстракт з бичачого серця з лецетином і холестерином – кардіоліпідний антиген;

3) неспецифічний антиген – спиртовий екстракт ліпоїдів із м’язів серця бика з холестерином.

Схема виконання основного досліду реакції Васермана

Інгредієнти	Пробірка №1	Пробірка №2	Пробірка №3	Пробірка №4
Сироватка крові хворого, інактивована і розведена 1:5	0,5см³	0,5 см³	0,5 см³	0,5 см³
Антиген №1(специфічний)	0,5 см³	-	-	-
Антиген №2(неспецифічний)	-	0,5 см³	-	-
Антиген №3(неспецифічний)	-	-	0,5 см³	-
Комплемент (робоча доза)	0,5 см³	0,5 см³	0,5 см³	0,5 см³
Ізотонічний розчин NaCl (натрія хлориду)	-	-	-	0,5 см³

Термостат при температурі 37⁰С упродовж 45 хв.

Гемолітична система сенсибілізована

1,0 см³

Термостат при температурі 37⁰С упродовж 1 год.

Результат:

Пробірка №1

Пробірка №2

Пробірка №3

Пробірка №4

з сироваткою хворого сифілісом

-Г

+Г

з нормальною сироваткою

+Г

-Г гемолізу немає ; + Г гемоліз

Облік результатів проводиться після настання гемолізу у всіх контролях.

Результати реакції оцінюють за 4 плюсовою системою:

·Позитивна реакція – коли є повна або значна затримка гемолізу (4+, 3+);

·Слабопозитивна реакція – часткова затримка гемолізу (2+);

·Сумнівна реакція – незначна затримка гемолізу (1+).

·В разі виникнення повного гемолізу РВ вважають негативною

Кожну сироватку, що дала позитивну якісну реакцію, необхідно дослідити і кількісним методом з послідовним її розведенням від 1:10 до 1:640

Висновок:

В разі виникнення повного гемолізу реакція вважається від’ємною.

У 50% хворих реакція стає додатною після появи твердого шанкру. В другому і третьому періодах сифілісу 75-90% додатних реакцій. Після лікування реакція Васермана від’ємна.

31. Здійснити серологічну діагностику бруцельозу. Врахувати результати реакції Райта. Зробити висновок.

Для серологічної діагностики бруцельозу застосовують:

Ø Реакція Райта – розгорнута реакція аглютинації.

Ø Реакція Хеддельсона – прискорений і спрощений варіант реакції аглютинації з бруцельозним діагностикумом. Ставиться на площині знежирених скляних пластин.

Ø Реакція зв’язування комплементу (РЗК)

Ø Реакція непрямої гемаглютинації з еритроцитарним бруцельозним полісахаридним діагностикумом (РНГА).

Схема постановки реакції Райта:

Інгредієнти, мл	Пробірки
	Дослід					Контроль сироватки (КС)	Контроль діагностикума (КД)
	1	2	3	4	5	6	7
Ізотонічний розчин хлориду натрію	-	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Сироватка в розведенні 1:25	0,5	0,5→	0,5→	0,5→	0,5↑	0,5	-
Діагностикум	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	-	0,5
Розведення сироватки	1:50	1:100	1:200	1:400	1:800	-	-

Термостат 37^оС 18-24 годин.

Примітка: у першу і другу пробірки додають 0,5 мл сироватки, перемішують. З другої пробірки 0,5 мл суміші переносять до наступної (третьої) пробірки, продовжуючи розведення до п’ятої пробірки, з якої 0,5 мл суміші видаляють.

Висновок: Діагноз вважають підтвердженим при аглютинації у розведенні 1:200 і більше.

32. Врахувати результати серологічної діагностики туляремії. Зробити висновок.

Починаючи з 10-12 дня хвороби ставлять об’ємну реакцію аглютинації, яка за

методикою не відрізняється від реакції Райта.

·У хворого беруть 2-3 мл крові з ліктьової вени або пальця, отримують сироватку, яка повинна бути абсолютно прозорою.

·Реакцію ставлять із розведеннями сироватки від 1:50 до 1:800, супроводжуючи її відповідними контролями.

·Антигеном в реакції аглютинації служить туляремійний діагностикум, в 1 мл

якого міститься 10 млрд мікробних тіл. Перед вживанням його розводять у 10 разів

Компоненти:

·0,85 % розчин NaCl

·Сироватка хворого, 1:25

·Діагностикум туляремійний

·Розведення сироватки

·Пробірки струшують і ставлять у термостат на 2 год, потім витримують 18-20 год при кімнатній температурі і аналізують результати.

·Діагностичне значення має титр 1:100. Така концентрація антитіл настає в кінці 2-го тижня, після чого титр аглютинів наростає у 4-8 разів, в той час як у перехворілих раніше він залишається практично незмінним.

33. Врахувати результати реакції аглютинації, поставленої з метою серологічної діагностики висипного тифу. Зробити висновок.

Для макроскопічної реакції аглютинації Вейгля використовують корпускулярний рикетсіозний антиген (500 млн клітин/мл). Сироватку хворого розводять від 1:40 до 1:1280 в об’ємі 0,25 мл і в кожну пробірку добавляють по 0,25 мл антигену (табл. 65). При цьому необхідно враховувати, що після внесення антигену розведення сироватки подвоюється.

Облік реакції проводять неозброєним оком або за допомогою аглютиноскопа через 2 год після того, як пробірки вийняли з термостата. Аглютинат рикетсій виглядає як ніжний, дрібнозернистий осад на дні пробірки, інтенсивність якого позначають за чотириплюсовою системою. Реакцію Вейгля вважають високоспецифічною. Вона випадає в діагностичному титрі 1:40-1:80 і більше майже у100 % хворих на висипний тиф вже на 4-5-й день хвороби. Ще більш достовірні результати отримують при постановці реакції методом парних сироваток.

Схема постановки реакції аглютинації Вейгля
Схема постановки реакції аглютинації Вейгля

Компоненти, мл				Номер пробірки
Компоненти, мл	1		2	3	4	5	6	7 (контр.)
	1		2	3	4	5	6	7 (контр.)
Ізотонічний розчин хлориду	0,25		0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
натрію	0,25		0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
натрію
Сироватка хворого 1:10	0,25→		→	→	→	→	↓	-
Антиген рикетсій Провачека	0,25		0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Остаточне розведення	1:40		1:80	1:160	1:320	1:640	1:1280	-
сироватки	1:40		1:80	1:160	1:320	1:640	1:1280	-
сироватки
Експозиція в термостаті 18 год	при 37 °	С

34. Пояснити, як визначається колі-титр і колі-індекс води методом мембранних фільтрів. Врахувати результати і зробити висновок.

Колі-титр – найменший об’єм води (в мл) або щільної речовини (в г), в якому виявляють одну бактерію групи кишкової палички. Визначають бродильним методом або методом мембранних фільтрів. Для централізованої питної води цей показник має бути не менше 300.

Колі-індекс – кількість бактерій групи кишкової палички (коліформних бактерій) у літрі води. Колі-індекс питної води не має перевищувати 3. Визначають методом мембранних фільтрів.

Метод мембранних фільтрів –фільтрування води через мембранні фільтри з наступним їх інкубуванням при 37 ° С на фуксин-сульфітному середовищі (Ендо) і підрахунком колоній, типових для групи кишкової палички. Результати аналізу виражаються в вигляді колі-індексу (кількості кишкових паличок, що містяться в 1 л води).

Бактерії групи кишкової палчики є індикаторами фекального забруднення і їхнє виявлення служить обґрунтуванням непридатності використання води або іншого харчового продукту. Для їхнього виявлення найчастіше використовують середовище Ендо, на якому ці бактерії утворюють характерні колонії з металевим полиском, навколо яких середовище набуває червоного забарвлення внаслідок взаємодії з кислотою яку продукують бактерії.

35. Пояснити, як визначається мікробне число води. Врахувати результати і зробити висновок.

Мікробне число — це кількість колоній, що виростають унаслідок посіву 1 мл води на м'ясо-пептонний агар після 24 год вирощування за температури 37 і 20 °С. Мікробне число характеризує загальне бактеріальне обсіменіння води. Раптове підвищення мікробного числа може свідчити про забруднення.

Порядок проведення роботи:

У три чашки Петрі з МПА внести 0,05, 0,1 і 0,2 мл питної води й розтерти шпателем Дригальського. Аналізуючи воду з різних водойм, особливо багатих органічними речовинами, необхідно перед висіванням її розвести у пропорції не менше ніж 1:1000. Для цього використовують ряд пробірок із 9-ма мл стерильної водопровідної води або фізіологічного розчину, їх нумерують (цю роботу виконує лаборант). 1 мл досліджуваної води внести стерильною піпеткою у пробірку No 1, ретельно перемішати, продуваючи повітря, відібрати 1 мл речовини й перенести у пробірку No 2. Після перемішування таку ж кількість речовини перенести у пробірку No 3 (розведення 1:1000). Із пробірки No 3 висіяти по 0,05, 0,1 і 0,2 мл у чашки Петрі (рис. 11). Розтерти шпателем Дригальського, чашки підписати й поставити в термостат із 30 °С.

Норма: Кількість мікроорганізмів в 1 см3 води (мікробне число), не більше 100

Висновок: більше чи менше норми.